本文標(biāo)題：" 細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)測(cè)定法-生物顯微鏡專業(yè)門市"

細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)測(cè)定法-生物顯微鏡專業(yè)門市

細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)（intracellular reactive oxygen species; ROS）之測(cè)定法

一、原理

H2DCF-DA 是一種染劑對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）相當(dāng)敏感，可用來(lái)偵測(cè)細(xì)

胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化物質(zhì)。H2DCF-DA 為不具螢光的物質(zhì)，加至培養(yǎng)液中可經(jīng)

由擴(kuò)散作用通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；而細(xì)胞內(nèi)的酵素酯醣（esterase）會(huì)對(duì)

H2DCF-DA 進(jìn)行去乙醯化作用（deacetylation），進(jìn)而形成極性的化合物

（H2DCF），因?yàn)?H2DCF 無(wú)法穿透細(xì)胞膜并被留在細(xì)胞內(nèi)；由于其不具螢光

的特性，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有過(guò)氧化物質(zhì)存在時(shí)，會(huì)使 H2DCF 氧化而成為具有螢

光的產(chǎn)物（DCF）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)產(chǎn)生量越多，H2DCF 被氧化成帶螢

光的產(chǎn)物（DCF）相對(duì)提高；故，利用偵測(cè) DCF 螢光強(qiáng)度即可得知細(xì)胞內(nèi)

活性氧物質(zhì)產(chǎn)生之多寡

并以相對(duì)螢光單位（relative fluorescent unit, rfu）為計(jì)量單位，表示細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的相對(duì)含量

二、螢光染劑：2,7-dichloridihydrofluorescein（H2DCF-DA）: Sigma/molecular probe

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 移除 24 孔盤中的培養(yǎng)液，再加入 500μl 新的培養(yǎng)液。

2. 每孔加入濃度為 20 mM 的 H2DCF-DA，隨即將 24 孔盤置于細(xì)胞螢光測(cè)

定儀上（cytofluormetry）；設(shè)定激發(fā)（excitation）波長(zhǎng)為 485 nm，發(fā)散

（emission）波長(zhǎng)為 530；每三分鐘測(cè)讀一次，共計(jì)三十分鐘

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